甘肃中医药大学研究生(甘肃中医药大学研究生院)




甘肃中医药大学研究生,甘肃中医药大学研究生院


放射性肺损伤( radiation-induced lung injury , RILI )包括前期放射性肺炎及后期放射性肺纤维化,是胸部放疗最常见的剂量限制性并发症 [1] 。由于 RILI 有许多促成因素和诊断环境,其报告的发病率差异显著,数据显示, RILI 发病率最高的是肺癌( 5% ~ 25% ),其次是纵隔淋巴瘤( 5% ~ 10% )和乳腺癌( 1% ~ 5% ) [2] 。 RILI 的发生不仅限制了放疗的最高剂量,降低了肿瘤的控制率,而且可导致呼吸困难等症状,影响患者生活质量,甚至后期可进展为呼吸衰竭,威胁患者生命。目前 RILI 的发病机制尚未完全阐明,国内外尚无针对 RILI 的特效药 [3] 。吡非尼酮是美国胸科学会 / 欧洲呼吸学会 / 日本呼吸学会 / 拉丁美洲胸科学会( ATS/ERS/JRS/ALAT ) 2022 年更新的临床实践指南中,推荐用于治疗特发性肺纤维化的药物之一,具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等特性 [4-6] ,可用于治疗 RILI 。然而,长期应用吡非尼酮可能会使患者出现胃肠道症状、皮肤不良反应以及肝功能损伤等不良反应,在美国的一项 III 期临床试验中, 14.4% 的患者因为其不良反应不得不停止用药 [7] 。近年来,中医药在干预 RILI 的发生发展上取得了较好的疗效 [8-9] ,因此,研究中医药防治 RILI 并探索其作用机制具有重要临床意义。

红芪多糖是甘肃省道地药材红芪 Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz. 中提取出的主要活性物质,具有抗炎、抗氧化、机体保护、免疫调节等多种药理作用 [10-14] 。此外,文献报道红芪多糖对内毒素诱导的急性肺损伤具有保护作用 [15] 。本课题组前期研究发现,红芪多糖可以明显改善博来霉素诱导的肺间质纤维化 [16-17] ,而红芪多糖是否可以改善 RILI 目前尚未见报道。基于此,本研究建立 RILI 小鼠模型,通过小鼠肺功能检测、 CT 影像学检测、组织病理学检测等手段初步探讨红芪多糖对 RILI 的防治作用及机制。

1材料

1.1动物

SPF 级雌性 C57BL/6J 小鼠 56 只, 6 ~ 8 周龄,体质量( 20 ± 2 ) g ,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物质量合格证号 SCXK (京) 2019-0010 ,实验动物设施使用证号 SYXK (甘) 2020-0009 。动物饲养于甘肃中医药大学实验动物中心,室温( 23 ± 2 ) ℃ ,相对湿度 40% ~ 52% , 12 h 光照 / 12 h 黑暗交替,动物自由进食饮水。动物实验经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号 2021-241 )。

1.2药材

红芪饮片购自甘肃省陇南市安化镇,经甘肃省药品检验研究院马潇主任药师鉴定为豆科植物多序岩黄芪 H. polybotrys Hand.-Mazz. 的干燥根,符合《中国药典》 2020 年版规定。

1.3药品与 试剂

吡非尼酮胶囊(国药准字 H20133376 ,批号 20210414 )购自北京康蒂尼药业股份有限公司; D – 无水葡萄糖(质量分数≥ 98% ,批号 B21882 )购自上海源叶生物科技有限公司;肿瘤坏死因子 -α ( tumor necrosis factor-α , TNF-α ) ELISA 试剂盒(批号 2111M33 )、白细胞介素 -6 ( interleukin-6 , IL-6 ) ELISA 试剂盒(批号 2111M25 )购自江苏菲亚生物科技有限公司;甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase , GAPDH ) 抗体(批号 B1501 )、 TNF-α 抗体(批号 B7201 )、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mammalian target of rapamycin , mTOR )抗体(批号 N1301 )、 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体(批号 B0201 )均购自美国 Immunoway 公司;缺氧诱导因子 -1α ( hypoxia-inducible factor-1α , HIF-1α )抗体(批号 GR3368586-5 )购自英国 Abcam 公司;血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor , VEGF )抗体(批号 No.43866 )购自美国 GeneTex 公司。

1.4仪器

MF-RO-10 型实验动物饮用水处理器(杭州永洁达净化科技有限公司); X-RAD225 型生物辐照仪(美国 Precision X-ray 公司); Inlivew-3000B 型动物 PET/SPECT/CT (北京永新医疗设备有限公司); WPB PLT-UNR-RT-2 型动物肺功能仪(德国 EMKA 公司); SpectraMax i3x 型多功能酶标仪(美国 Molecular Devices 公司); UV-power 型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司); SCIENTZ-48 型高通量组织研磨器(宁波新芝生物科技股份有限公司); WD-9405F 型脱色摇床、 DYY-60 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司); SFC-182 型生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。

2方法

2.1药物制备

2.1.1红芪水煎液制备红芪饮片加入8 倍量纯水浸泡6 h 后,煎煮1.5 h ,滤过,再加入6 倍量纯水煎煮1.5 h ,合并2 次滤液,浓缩得红芪水煎液。

2.1.2红芪多糖提取纯化 红芪水煎液离心取上清液,进行 4 次醇沉(分别加入无水乙醇使溶液乙醇体积分数达到 70% 、 80% 、 80% 及 90% ),每次醇沉后静置 24 h ,取沉淀加入纯水溶解,离心,取上清液进行下一次醇沉。 90% 乙醇醇沉后滤过取沉淀,用无水乙醇洗 3 遍, 50 ℃ 烘干后得红芪粗多糖。将红芪粗多糖用纯水配制为 15 mg/mL 多糖溶液,加入 10% 三氯乙酸溶液(多糖溶液与三氯乙酸溶液体积比为 4 ∶ 1 ),低温剧烈振荡 30 min ,离心,取上清液,加入 3 倍体积 95% 乙醇溶液醇沉,滤过,干燥后得红芪多糖, 1 kg 红芪饮片提取纯化得红芪多糖 6 g 。

2.1.3红芪多糖质量分数测定 以无水葡萄糖为标准品,配制质量浓度分别为0.024 、0.035 、0.047 、0.059 、0.071 mg/mL 的葡萄糖溶液,苯酚硫酸法显色后通过紫外分光光度仪于485 nm 处测得吸光度(A )值分别为0.244 、0.362 、0.501 、0.629 、0.750 ,以质量浓度为横坐标(X ),A 值为纵坐标(Y )进行回归分析,得线性回归方程Y =10.808 X - 0.014 ,r =0.999 7 。精密配制0.042 mg/mL 红芪多糖溶液,测得A 值为0.364 ,代入回归方程得所提红芪多糖质量分数为83.27% 。

2.2动物分组模型制备及给药

将 56 只雌性 C57BL/6J 小鼠随机分为对照组、模型组、红芪水煎液( 5 g/kg )组及红芪多糖低、中、高剂量( 15 、 30 、 60 mg/kg )组和吡非尼酮( 200 mg/kg )组,每组 8 只。所有小鼠 ip 3% 戊巴比妥钠( 40 mg/kg )麻醉,除对照组外,其余各组小鼠均仰卧固定于动物台,充分暴露肺部,进行单次 16 Gy 全肺 X 线辐照,未照射部位用铅块屏蔽,照射距离为 48 cm ,剂量率为 2 Gy/min ,照射时间 8 min ;对照组麻醉后佯装辐照。自造模前 7 d ,各给药组 ig 相应药物( 20 mL/kg ),对照组和模型组 ig 等体积 0.9% 氯化钠溶液, 1 次 /d ,连续 5 周。

2.3一般状况观察

观察小鼠毛发改变、精神状态、活动度等,每周定时测量并记录小鼠体质量。于造模后 28 d 取材时测量肺组织质量并计算小鼠肺指数。

肺指数=肺质量 / 体质量

2.4肺功能检测

于取材前 1 d 运用无约束全身体积描记仪对各组小鼠进行清醒状态下肺功能检测。将小鼠放入动物体积描记箱中,待其呼吸状态平稳时记录肺功能指标,包括吸气时间( Ti )、呼气时间( Te )、潮气量( TV )、每分钟通气量( MV )、吸气气流高峰( PIF )、呼气气流高峰( PEF )。

2.5CT检测

分别于造模 1 d 前及肺功能检测结束后,对小鼠进行麻醉后 CT 检测。各组小鼠 ip 3% 戊巴比妥钠( 40 mg/kg )麻醉,以俯卧位放置于小动物 PET/CT 床位,勾选全肺进行 CT 扫描。采用 NMsoft-AIWS V1.7 图像处理软件将扫描结果断层重建后融合显示,选用 3D 等值线限定 CT 值 Min = − 1000 HU 、 Max = 0 勾选全肺,软件统计小鼠肺部平均 CT 值。

2.6肺组织病理学检测

各组小鼠麻醉后,股动脉取血,脱颈椎处死,取左肺,以 10% 甲醛溶液固定,经脱水、包埋、切片后,进行苏木素 – 伊红( HE )染色。采用 Szapiel 法评价肺泡炎症程度 [18] :无肺泡炎症,记 0 分;轻度肺泡炎,肺泡间隔略微增宽,其间有炎性细胞浸润,病变面积小于全肺 20% ,记 1 分;中度肺泡炎,病变面积占全肺 20% ~ 50% ,记 2 分;重度肺泡炎,病变面积占全肺 50% 以上,记 3 分。

2.7ELISA检测血清中TNF-αIL-6水平

各组小鼠全血常温静置 2 h 后, 4 ℃ 、 3000 r/min 离心 15 min ,分离血清。按照 ELISA 试剂盒说明书检测小鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 水平。

2.8Western blotting检测肺组织中TNF-α、mTOR、VEGFHIF-1α蛋白表达

取各组小鼠右肺组织,加入蛋白裂解液,低温匀浆裂解,用高通量组织研磨器( 70 Hz )充分研磨肺组织, 4 ℃ 、 12 000 r/min 离心 15 min ,分离上清液。用 BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,上清液加入蛋白上样缓冲液,沸水浴 10 min ,蛋白样品于 −20 ℃ 保存备用。蛋白样品经十二烷基硫酸钠 – 聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至 PVDF 膜,用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h 后,以 TBST 洗涤 3 次,分别加入相应抗体, 4 ℃ 孵育过夜; TBST 洗涤 3 次,加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体,室温孵育 2 h , TBST 洗涤后,均匀滴加 ECL 试剂,暗室曝光,用 Image J 1.48V 图像处理软件分析条带灰度值。

2.9统计分析

实验数据均采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析,计量数据中符合正态分布的以 表示,多组间比较进行单因素方差分析( One-way ANOVA ),方差齐时多重比较采用 LSD 法检验,方差不齐时采用 Tamhane’sT2 法检验。

3结果

3.1一般状况观察

3.1.1小鼠生存状况 如图 1 所示,对照组小鼠在实验过程中动作敏捷、精神良好、皮毛光泽。其余各组小鼠在辐照后均出现不同程度的动作减缓、精神萎靡。各给药组小鼠在辐照后 7 d 左右动作、精神状况逐渐恢复,模型组及吡非尼酮组小鼠恢复较慢。小鼠在辐照后 21 d 左右出现辐照部位毛发脱落。

3.1.2小鼠体质量变化 如图 2 所示,辐照后,除对照组小鼠体质量平缓上升外,其余各组小鼠体质量均在 7 d 内呈下降趋势, 7 d 后小鼠体质量开始逐渐恢复并上升。其中,模型组及吡非尼酮组上升最慢,红芪多糖高剂量组上升最快。 7 ~ 21 d ,与对照组比较,模型组小鼠体质量显著降低( P < 0.01 )。 14 d 时,与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组小鼠体质量显著增加( P < 0.05 、 0.01 )。 21 d 时,除吡非尼酮组外,其余各给药组小鼠体质量均高于模型组( P < 0.01 )。

3.2肺组织病理学观察

如图 3 所示,对照组小鼠肺组织无明显病 理学 改变,结构清晰,轮廓完整。模型组小鼠肺组织破坏严重,可见支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡间隔明显增宽,肺间质有大量炎性细胞浸润,血管肌层增厚,周围水肿。与模型组比较,各给药组均能在一定程度减轻小鼠肺组织炎症反应,其中红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组效果较为明显。

如表 1 所示,与对照组比较,模型组小鼠肺指 数和肺泡炎评分显著升高( P < 0.01 );与模型组比较,红芪多糖低、中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺指数显著降低( P < 0.01 ), 吡非 尼酮组和红芪多糖中、高剂量组小鼠肺泡炎评分显著降低( P < 0.05 、 0.01 )。

3.3小鼠肺功能检测

于辐照后 27 d 对小鼠进行清醒状态下肺功能检测,如表 2 所示,与对照组比较,模型组小鼠 Ti 、 TE 显著升高( P < 0.01 ), PIF 、 PEF 、 TV 及 MV 显著降低( P < 0.01 )。与模型组比较,红芪多糖低、中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠 Ti 、 TE 均显著降低( P < 0.05 、 0.01 ), MV 显著升高( P < 0.01 );红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组 TV 及 PEF 显著升高( P < 0.05 、 0.01 )。

3.4小鼠肺组织CT值变化

如表 2 所示,辐照前各组之间小鼠肺部 CT 值无明显差异。辐照后 27 d ,与对照组比较,模型组小鼠肺部 CT 值升高( P < 0.01 );与模型组比较,红芪多糖高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺部 CT 值显著降低( P < 0.01 )。


3.5
血清中TNF-αIL-6水平

如图 4 所示,与对照组比较,辐照 28 d 后模型组小鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 水平均显著升高( P < 0.01 );与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组小鼠血清中 TNF-α 和 IL-6 水平均显著降低( P < 0.05 、 0.01 )。

3.6肺组织中TNF-α、mTOR、VEGFHIF-1α蛋白表达

如图 5 所示,与对照组比较,辐照28 d 后模型组小鼠肺组织中TNF-α 、mTOR 、VEGF 及HIF-1α 蛋白表达水平均显著升高(P <0.01 );与模型组比较,红芪多糖中、高剂量组及吡非尼酮组肺组织中TNF-α、mTOR、VEGF及HIF-1α蛋白表达均水平显著降低(P<0.05、0.01)。

4讨论

RILI 从临床上主要分为炎症期和纤维化期,炎症期常发生于 1 ~ 3 个月,纤维化期常发生于 6 ~ 24 个月,而从分子水平观察, RILI 则是一个连续进展的过程。肺部辐照产生大量的活性氧和活性氮,氧化损伤 DNA 、脂质和蛋白质,从而导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤或凋亡。随后,许多炎性细胞被募集到损伤部位,并分泌大量细胞因子,进而产生一系列细胞因子级联反应,介导炎症反应及后期的纤维化 [19] 。由于肺纤维化的不可逆性及难治性,在肺炎时期采取积极的干预措施对防治 RILI 具有重要意义。

组织病理学、肺功能及 CT 影像学检测在诊断 RILI 中发挥重要作用,可有效评价 RILI 程度及发展阶段 [20] 。本研究根据文献调研及前期预实验结果综合分析,最终采用单次 16 Gy 全肺 X 线辐照建立 RILI 模型,于辐照后 28 d 取材。肺组织 HE 染色结果显示,模型组小鼠肺组织结构破坏严重,炎性细胞浸润明显;肺功能及 CT 检测结果显示,模型组小鼠肺功能明显受损,肺部 CT 值显著升高;而给予红芪多糖后可减少小鼠肺组织炎症细胞浸润,改善肺功能各项指标,降低肺部 CT 值。在肺功能检测结果中,红芪多糖组小鼠 PIF 虽较模型组有所提高,但差异不具统计学意义,可能是由于小鼠并没有自主用力吸气意识导致结果并不完全准确。 RILI 前期炎症 CT 影像学表现在动物模型中并不明显,可表现为均匀的斑片状、小结节状磨玻璃影或实变影等,在后期纤维化时可出现条状、带状纤维条索影等 [21] 。由于本研究只进行到辐照后 28 d ,小鼠尚未出现明显的肺纤维化,故通过比较各组间辐照前后 CT 值来统计分析 CT 结果。肺部 CT 值是 X 线辐照衰减在 CT 图像上的量化指标,能客观地评价肺组织密度,反映肺组织损伤程度,可应用于辅助诊断 RILI[22] 。以上结果表明 RILI 小鼠模型成功建立且红芪多糖对 RILI 具有一定保护作用。

在肺部辐照早期, TNF-α 、IL-6 等细胞因子的过度表达对RILI 的发生发展起到了重要作用。TNF-α 是RILI 炎症阶段的启动因子,通过诱导黏附分子的表达,招募炎性细胞到组织损伤部位,启动炎性细胞产生氧化物,从而发挥促炎作用[23] 。IL-6 是下丘脑- 垂体- 肾上腺轴的内源性调节因子,在炎症过程中的免疫- 神经内分泌调节中发挥重要作用[24] 。临床研究亦显示,循环IL-6 早期变化可作为预测放射性肺炎的指标[25] 。因此,检测小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平可在一定程度反映RILI 前期肺炎损伤情况,且在初始阶段对TNF-α 和IL-6 进行药理调控可能会阻止RILI 的进展。本研究发现模型组小鼠辐照后血清中TNF-α 及IL-6 水平显著升高,而红芪多糖可下调TNF-α 及IL-6 水平,提示红芪多糖减轻RILI 前期炎症损伤可能与抑制TNF-α 及IL-6 的释放有关。

Fleckenstein 等 [26] 研究发现, RILI 炎症期、纤维化期与组织缺氧有关。肺部辐照后几周内就会发生血管损伤,如内皮细胞肿胀导致毛细血管狭窄和闭塞、较大血管内纤维蛋白栓的形成及内皮细胞增生等,从而导致组织缺氧 [27] 。而在缺氧条件下, HIF-1α 激活 VEGF 过表达,从而促进血管内皮细胞增殖,诱导血管生成,增加血管通透性,导致肺高渗性水肿和毛细血管内皮细胞损伤,引起肺部炎症 [28-29] 。 mTOR 是 HIF-1α 的上游基因, mTOR 激活可以使 HIF-1α 入核,进而调控下游的 VEGF 表达,加重炎症损伤 [30] 。本研究结果显示,辐照后小鼠肺组织 mTOR 蛋白表达显著增加,并伴随着 HIF-1α 、 VEGF 及 TNF-α 上调;而红芪多糖可以降低小鼠肺组织中 mTOR 、 HIF-1α 、 VEGF 及 TNF-α 蛋白表达,表明红芪多糖改善 RILI 的作用可能与抑制 mTOR/HIF-1α/ VEGF 信号通路有关。

综上所述,红芪多糖有明显改善 RILI 炎症的作用,其机制可能与下调mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路从而抑制TNF-α 和IL-6 等炎症因子的释放有关。吡非尼酮改善RILI 前期炎症的总体效果优于红芪多糖,但从体质量变化趋势分析,吡非尼酮组小鼠辐照后体质量下降明显且恢复较慢,考虑为吡非尼酮诱发小鼠出现胃肠道反应甚至肝损伤所致。而红芪多糖中、高剂量组对前期肺炎也有较好的治疗作用,且辐照后体质量均快速回升,并未出现不良反应。由此可以考虑为红芪多糖的毒副作用低于吡非尼酮,需要进一步深入研究。本研究只进行到辐照后28 d ,病理上处于放射性肺炎阶段,关于红芪多糖对RILI 后期肺纤维化阶段的作用效果及机制有待后续探索研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献(略)

来 源:王 强,王 艺,张 莉,尚 芸,李亮亮,杜籼芹,李 爽,蔺兴遥.基于mTOR/HIF-1α/VEGF通路研究红芪多糖防治放射性肺损伤的作用机制 [J]. 中草药, 2022, 53(21): 6771-6779 .

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甘肃中医药大学研究生(甘肃中医药大学研究生院)

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